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Une nouvelle technique d’analyse protéomique est disponible sur la plateforme 3P5

Cell reports cover

La plateforme de protéomique 3P5 a récemment mis en place au sein de l’Institut Cochin une technique d’analyse protéomique par spectrométrie de masse sans marquage, dite analyse « label free », initialement développée par l’équipe de Matthias Mann, du Max Planck Institut für Biochemie.

Lors de sa prise en main par la plateforme, la technique label free a permis à l’équipe de Patrick Mayeux d’identifier plus de 7500 protéines et d’en quantifier plus de 6100 sur le modèle de la différenciation érythroïde humaine, depuis le stade de progéniteur engagé (BFU-E), jusqu’au stade d’érythroblaste acidophile, dernier stade de la différenciation avant énucléation (Gautier et al., Cell Reports, 2016). La précédente analyse protéomique de l’érythropoïèse, publiée en 2009, avait seulement permis d’identifier 21 protéines différentiellement exprimées, par la méthode de 2D-DIGE (Richardson et al, Proteomics Clin Appl, 2009). L’étude par la technique label free représente donc une avancée considérable dans l’étude de l’évolution d’un protéome au cours d’un mécanisme complexe comme la différenciation et met notamment en évidence l’expression de nombreux nouveaux acteurs potentiels.

Outre la grande quantité de protéines quantifiées qu’elle permet d’obtenir, la technique label free apporte une dimension supplémentaire aux analyses par l’obtention de la quantification absolue des protéines en unité d’intensité LFQ (pour label Free Quantification), voire, dans certains cas, en nombre de copies par cellule. Ainsi, dans l’étude de l’érythropoïèse, la quantification des protéines a été calculée en nombre de copies par cellule, indicateur pertinent dans un système de différenciation au cours duquel les cellules subissent une forte réduction de taille, et qui permet de comparer, en plus de leurs profils, le niveau d’expression des différentes protéines. Par exemple, le facteur de traduction eIF4E et son inhibiteur 4EBP1 (connu pour être sous le contrôle de la voie mTORC1), présentent un niveau d’expression équivalent aux stades progéniteurs, alors qu’en fin de différenciation, l’expression de 4EBP1 diminue plus fortement que celle de eIF4E favorisant très nettement l’expression de eIF4E. Ceci suggère un fort contrôle de la traduction en début de différenciation via la voie mTORC1, qui est très fortement diminué en fin de différenciation.

Par ailleurs, la méthode label free permet d’obtenir une quantification pour des protéines ayant des niveaux d’expression très différents au sein d’un même échantillon. Ainsi, la gamme d’expression des protéines quantifiées au cours de la différenciation érythroïde s’est étendue sur 7 logs, allant de quelques dizaines de copies pour des protéines telles que MYB à plusieurs centaines de millions de copies par cellule pour des protéines telles que les globines a et b.

Enfin, la comparaison des résultats de l’étude protéomique par la technique label free avec plusieurs études transcriptomiques de l’érythropoïèse humaine, a permis d’observer, comme c’est souvent le cas dans de nombreux autres systèmes, que la corrélation entre taux d’ARNm et protéines est faible, renforçant l’intérêt des analyses protéomiques.

La technique label free est aujourd’hui accessible à l’ensemble des chercheurs de l’institut Cochin et de l’université Paris Descartes, mais également aux chercheurs extérieurs, de la recherche publique ou privée.

 

Marquage versus label free

Figure

En 3 ans, la plateforme de protéomique 3P5 à l'institut Cochin a opéré un changement important de stratégie pour les analyses quantitatives globales : les techniques de marquage (SILAC, iTRAQ et autres TMT...) privilégiées jusqu'ici permettent de multiplexer les échantillons et d'analyser ainsi plusieurs conditions expérimentales en une seule injection en LC-MS protéomique. Deux avantages principaux : réduction des biais expérimentaux et du temps d'analyse. Ceci est crucial lorsqu'un seul appareil est disponible. L'inconvénient de ces techniques est soit de devoir incorporer des acides aminés "alourdis" à des cellules en culture dans le cas du SILAC (3 conditions en multiplexage maxi), soit de coller chimiquement des "étiquettes massiques" aux peptides en fin de préparation d'échantillon. C'est notamment le cas des techniques à fragments rapporteurs type iTRAQ ou TMT permettant jusqu'à 10 conditions en multiplexage.

Néanmoins, en quelques années le parc matériel de 3P5 s'est enrichi de deux spectromètres haute résolution* et permet plus de disponibilité pour réaliser des séries d'analyses plus longues et ne comportant pas de marquage (Label Free Quantification ou LFQ). Le biais technique est alors gommé par les réplicats biologiques (n=4) et le nombre de conditions à comparer n'est plus limité mais requiert la plus grande stabilité de performances LC et MS. Par ailleurs les logiciels gratuits développés par l'équipe de M. Mann & J.Cox (ref http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2016.136) permettent de réaliser des comparaisons de larges volumes d'analyses dont les variations éventuelles peuvent être réalignées et "matchées" par comparaisons inter-expérimentales (cf. figure). Cette option précieuse permet de réaliser des identifications et quantifications par homologie lorsque le spectromètre n'a pas pu réaliser d'identification par MS/MS. Ainsi le nombre de protéines quantifiées par échantillon s'accroît avec le nombre d'échantillons inclus dans l'étude. Le fruit de ces comparaisons reste bien sûr contrôlé par des outils statistiques adéquats qu'il est impératif de maitriser (http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3901).

L'adaptation de ces nouveaux outils a donc nécessité une forte implication du personnel de la plateforme, mais aussi des équipes utilisatrices pour se former aux manipulations de larges volumes de données protéomiques et génomiques. En effet, le nombre d'identifications/quantifications atteint de 3000 à 8000 protéines selon le type et la différenciation cellulaire, une profondeur d'analyse proche de l'exhaustivité estimée des gènes exprimés pour un type cellulaire donné (http://dx.doi.org/10.1038/nature13302 et http://dx.doi.org/10.1038/nature13319). Des outils de bioanalyse à péage (Ingenuity Pathway Analysis ou IPA) accessibles sur la plateforme permettent un tri précieux des données d'identification et de quantification. Un "accélérateur bibliographique" en quelque sorte, avec un accompagnement pour les novices.

* un spectromètre de type "Qexactive" Orbitrap cofinancé par le gis IBiSA (33%), l'INCA (13%) et l'Université Paris Descartes (54%) en 2013, et un spectromètre de type Orbitrap "Fusion" cofinancé par l'UE en fonds "FEDER" (50%), le cancéropole IdF (25%) et l'Université Paris Descartes (25%) en 2015

 

Points clés de la technique label free

  • Elle permet une analyse de protéomes entiers ou de sous-protéomes, sans marquage. Elle est donc adaptée à tous les types d’échantillons, cellules ou fluides biologiques
  • Il est possible de comparer un nombre illimité d’échantillons
  • Elle permet d’identifier et de quantifier un très grand nombre de protéines
  • Elle nécessite peu de matériel biologique (seulement 100 µg pour une analyse globale de protéome cellulaire)
  • Elle permet d’avoir accès à la quantification absolue en intensité LFQ (Label Free Quantification) d’un très grand nombre de protéines simultanément, et dans certaines conditions, en nombre de copies par cellule
  • Son coût est relativement faible (www.institutcochin.fr/les-plateformes/proteomique/tarifs)

 

Comment savoir si cette technique est adaptée à votre projet ?

Lors d’une première réunion, l’équipe de la plateforme de protéomique définit avec vous, la technique la plus adaptée à votre problématique. Elle vous aide également à mettre en place la préparation de vos échantillons jusqu’au culot sec ou au lysat cellulaire. C’est ensuite le personnel de la plateforme qui prend le relais jusqu’au rendu des résultats. Des outils d’analyses vous sont ensuite proposés pour extraire les informations pertinentes de votre jeu de données.

 

Contact

 

Abbreviations

3P5 : Plateforme Protéomique Paris 5

SILAC : Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture

iTRAQ : isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification (Applied/Life science)

TMT : Tandem Mass Tag (Pierce/Thermo)

LC : Liquid Chromatography

MS : Mass Spectrometry

 

Légende de la figure

Schématisation des comparaisons inter-expérimentales et des réalignements ou « match between runs » permis par les logiciels d’analyse développés par l’équipe de M. Mann et J. Cox.